Kit de coloração de células de envelhecimento -galactosidase

A capacidade de divisão da maioria das células normais é limitada. Quando não conseguem se dividir, entram em um estado de senescência, denominado senescência celular. A senescência celular é o mecanismo de garantia para que uma célula controle seu potencial de crescimento, o que geralmente significa senescência replicativa. As células normais param de se dividir após um número limitado de divisões e ocorre uma parada irreversível do crescimento. Neste momento, as células ainda estão vivas, mas ocorrem alterações significativas na morfologia celular e na atividade metabólica fisiológica, geralmente representadas por maior volume celular e ativação da -galactosidase associada ao envelhecimento. -galactosidase é uma enzima hidrolítica nos lisossomos celulares. Geralmente é ativo em pH 4.0, mas é ativo em pH 6.0 em células senescentes. Este kit é baseado neste fenômeno e princípio para corar tecidos ou células envelhecidas contra a regulação positiva do nível de atividade da -galactosidase associado ao envelhecimento. O princípio da reação específica é que X-Gal é usado como substrato, e a -galactosidase específica de células senescentes catalisa o substrato para gerar o produto azul, que é representado por sedimento azul no citoplasma da célula, que pode ser observado ao microscópio óptico. . Segundo o cálculo de que a quantidade de solução corante para cada amostra é de 1 mL, o kit pode completar a coloração de 100 amostras.

Transporte de gelo úmido; Armazenar a 2-8 graus de distância da luz, válido por 12 meses. Se o pó X-Gal for preparado em uma solução, ele será dividido em pequenas partes e armazenado a -20 grau, que é eficaz em 3 meses.

Preparação de reagentes

1. Prepare seu próprio buffer PBS (G4202 recomendado).

2. 100 mg de pó de X-Gal foi totalmente dissolvido e misturado com 5 mL de DMF (dimetilformamida) e, em seguida, dividido em tubos de centrífuga limpos de 1,5 mL, 0,5 mL para cada tubo, e armazenado em {{8} } grau de distância da luz. Evite congelamentos e descongelamentos repetidos.

3. Preparação da solução corante de -galactosidase de acordo com a proporção da tabela abaixo. Para células cultivadas em 6-placas de poços, é necessário 1,0-1,5 mL de solução de trabalho de coloração por poço, e para 12-placas de poços, 0.{{8 }}.0 mL de solução de trabalho de coloração são necessários por poço. A solução corante foi preparada de acordo com o tamanho da amostra para evitar desperdício.

1. Para células aderentes

(1) As células cultivadas (ou folhas de rastreamento celular) em 6- placas de poços foram aspiradas e o meio de cultura celular foi removido, lavado duas vezes com PBS e 1 mL de solução de fixação de coloração de -galactosidase foi adicionado, e as células foram fixado por 15 minutos à temperatura ambiente.

(2) A solução fixada foi descartada e as células foram lavadas com PBS por 3 vezes, 2 min de cada vez.

(3) O PBS foi removido por sucção com uma pipeta e 1 mL de solução de trabalho de coloração de -galactosidase foi adicionado a cada poço e incubado a 37 graus durante 2 horas até durante a noite. Nota: Não incube em incubadora de dióxido de carbono a 37 graus. Durante o período de coloração, o desenvolvimento da cor deve ser observado com o tempo. Se a expressão de -galactosidase na amostra for elevada, a coloração pode ser concluída em poucas horas. Se a expressão de -galactosidase for baixa, o tempo de incubação deve ser prolongado adequadamente, durante o qual a placa de poços 6- deve ser selada com filme plástico ou parafilme para evitar que a evaporação do líquido afete os resultados da coloração.

(4) Sob o microscópio óptico comum, a solução corante foi removida depois que as células positivas desenvolveram cor. Se os núcleos precisarem ser contrastados, adicione uma pequena quantidade de solução Nuclear Fast Red (G1035 é recomendado) para a placa de poço para cobrir as células e corar à temperatura ambiente durante 3 min, remover a solução de coloração e lavar com PBS várias vezes.

(5) 2 mL de PBS foram adicionados para cobrir as células e a coloração foi completada. A amostra pode ser armazenada a 4 graus por 1 semana. Ou adicione 70% de glicerol para cobrir as células, 4 graus podem ser armazenados por muito tempo. Se for a folha de escalada celular, a folha de escalada pode ser totalmente seca, xileno transparente após deixar cair a folha de vedação de goma neutra, pode ser armazenada por um longo tempo.

2. Para seções congeladas

(1) Reaqueça as seções congeladas em temperatura ambiente por 10 min. Circule o tecido com pinceladas de tecido.

(2) Uma quantidade adequada de solução de fixação de coloração de -galactosidase foi adicionada ao tecido para cobrir completamente o tecido, e a solução foi fixada à temperatura ambiente durante 20 min.

(3) As secções de tecido foram embebidas e lavadas em PBS durante 3 vezes, 5 min de cada vez.

(4) As secções foram colocadas numa caixa húmida para evitar a luz, e uma quantidade apropriada de solução de coloração de -galactosidase foi adicionada ao tecido para cobrir completamente o tecido. A caixa úmida foi incubada a 37 graus e o desenvolvimento da cor foi observado ao microscópio a cada 2 horas. Se não fosse observado desenvolvimento de cor, a cultura continuava até que as células senescentes no tecido mostrassem cor. Se a amostra for incubada durante a noite, deve ser adicionada uma quantidade suficiente de solução corante de -galactosidase para evitar que a solução corante evapore e seque os comprimidos.

(5) Após o tecido desenvolver cor, a solução corante foi removida e os cortes foram imersos em PBS e lavados duas vezes, e depois imersos em água pura e lavados duas vezes.

(6) (opcional) Adicione solução Nuclear Fast Red (G1035 é recomendado) por 3 min e lave 3 vezes.

(7) Os cortes foram desidratados com etanol absoluto por 2 vezes, depois transparentes com xileno por 5 min de cada vez e depois selados com goma neutra.

3. Resultados de coloração

O citoplasma das células senescentes está espalhado em azul.

1. A solução X-Gal deve ser descongelada e completamente misturada à temperatura ambiente antes do uso.

2. A solução corante de -galactosidase A e B deve ser restaurada à temperatura ambiente com antecedência antes do uso, e a solução corante preparada deve ser bem misturada sem precipitação antes do uso.

3. A reação de coloração com -galactosidase de células senescentes depende de condições específicas de pH, portanto não pode ser incubada em CO₂incubadora para o desenvolvimento da cor, caso contrário, afetará o pH da solução de coloração e levará à falha da coloração.

4. Ao preparar a solução de tingimento, escolha consumíveis feitos de polipropileno (PP) ou vidro em vez de poliestireno (PS).

5. O desenvolvimento da cor deve ser observado várias vezes durante o período de desenvolvimento da cor de 2 horas durante a noite, um tempo muito curto pode levar a resultados negativos; muito tempo pode levar a falsos positivos. O tempo cromogênico está intimamente relacionado à quantidade de -galactosidase contida na própria amostra.

6. Antes de preparar a solução corante, verifique o valor do pH da solução corante A. Se não for 6.0 (que pode ser alterado devido às condições de armazenamento), ajuste o valor do pH para 6.{{4} } com HCl ou NaOH antes de usar.

7. A coloração de secções de tecido com -galactosidase requer alta preparação de amostras, que devem ser armazenadas a -80 grau e testadas o mais rápido possível. Dado que a -galactosidase é muito fácil de inactivar, o armazenamento inadequado ou demasiado longo da amostra pode levar à inactivação da enzima e, consequentemente, a nenhuma coloração positiva.

8. Use um jaleco e luvas descartáveis ​​durante a operação

Imagens:

As células Fig.1WI-38 foram coradas com kit -galactosidase. A imagem da esquerda mostra células WI-38 senescentes sem capacidade de divisão e proliferação, mas ainda vivas. Após a coloração, as células com coloração positiva foram superiores a 95%. A imagem à direita mostra células WI-38 recentemente ressuscitadas (passagem inicial) com menos de 3 passagens e nenhuma célula positiva óbvia após a coloração.

Somente para uso em pesquisa!

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