Kit de detecção de apoptose celular de anexina V-IF488/PI

 

Nome do produto	Gato. Não	Especificações.
Kit de detecção de apoptose celular de anexina V-IF488/PI	G1513-50T	50 T
	G1513-100T	100 T

 

 

A apoptose é um processo fisiológico normal que ocorre durante o desenvolvimento embrionário e a manutenção da homeostase tecidual e é acompanhada por muitas alterações morfológicas, entre as quais a perda da membrana celular é uma das características iniciais da apoptose. Nas células normais, a fosfatidilserina (PS) é distribuída apenas no lado interno da bicamada fosfolipídica da membrana celular. No entanto, na fase inicial da apoptose, o PS irá passar do lado interno da membrana lipídica para o lado externo, expondo-o para o exterior da célula. Anexina V é um Ca²⁺proteína de ligação a fosfolipídios dependente com alta afinidade por PS e pode se ligar especificamente a células expostas a PS. Portanto, a Anexina V é utilizada como um dos indicadores para detectar a apoptose precoce das células. O iodeto de propídio (PI) é um corante de ácido nucleico que não consegue penetrar nas células normais com membranas celulares intactas e células apoptóticas precoces, mas pode penetrar nas membranas celulares de células apoptóticas e necróticas tardias e manchar os núcleos celulares.

Este produto utiliza uma proteína de fusão composta por IF488 (proteína fluorescente verde aprimorada) e anexina V como sonda de detecção para detectar apoptose precoce de células. O PI também é usado para distinguir células vivas de células necróticas e apoptóticas tardias. Em combinação com Anexina V-IF488 e PI, as células vivas apresentam coloração negativa (Anexina V-/PI-), as células apoptóticas precoces apresentam fluorescência única positiva (Anexina V+/PI-), enquanto as células apoptóticas e necróticas tardias apresentam fluorescência dupla positiva ( Anexina V+/PI+). Este kit é adequado para detecção de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. Também é adequado para detecção quantitativa de células apoptóticas, pois o IF488 é fundido 1:1 à Anexina V.

 

 

Enviar com gelo úmido; Armazenar a 2-8 graus de distância da luz, válido por 12 meses.

 

 

Número do componente	Componente	G1513-50T	G1513-100T
G1513-1	Anexina V-IF488	250 μL	2×250 μL
G1513-2	Iodeto de propídio (PI)	250 μL	2×250 μL
G1513-3	1×amortecedor de ligação	25ml	2x25ml
Manual		1 unidade

 

 

1. Suspensão de células: Pegue a suspensão de células e colete as células por centrifugação a 500xg por 5 min a 4 graus.

2. Células aderentes: Colete o sobrenadante da cultura celular primeiro. Em seguida, digerir as células com tripsina sem EDTA (recomendado G4002 ou G4011), combinar com o sobrenadante da cultura celular e coletar as células por centrifugação a 500xg por 5 min a 4 graus. A digestão da tripsina não deve ser muito longa para evitar falsos positivos causados ​​pela digestão excessiva.

3. Lave as células duas vezes com PBS pré-resfriado (recomendado G4202) e colete as células por centrifugação a 500xg por 5 min a 4 graus de cada vez.

4. Ressuspender suavemente as células com 1×Binding Buffer pré-resfriado e ajustar a concentração celular para 1~5×10⁶/mL.

5. Adicione 5 μLofAnnexin V-EGFP e 5 μLofPI a 100 μL de suspensão celular, misture suavemente e proteja da luz em temperatura ambiente por 8-10 min.

6. Adicione 400 µL de 1×Binding Buffer pré-resfriado, agite suavemente e use citometria de fluxo ou microscópio de fluorescência para detecção dentro de 1 hora.

 

 

1. Detecção de citometria de fluxo

a) Selecione a voltagem apropriada e ajuste a compensação de luz para a análise do citômetro de fluxo. recomenda-se definir um controle negativo (sem Anexina V-IF488 e rotulagem PI) para ajustar a tensão, exceto para o grupo experimental, e o controle padrão único (apenas com Anexina V-IF488 e células com PI apenas) para ajuste de compensação .

b) Exemplo de referência de detecção e análise de citometria de fluxo: células de linfoma InduceJurkat T com 5 μM de camptotecina por 6 h. Referindo-se às etapas experimentais acima, use citometria de fluxo para detectar. Os resultados são mostrados na figura a seguir.

 

 

O comprimento de onda máximo de excitação do IF488 é 491 nm e o comprimento de onda máximo de emissão é 518 nm; o comprimento de onda máximo de excitação do complexo PI-DNA é 535 nm e o comprimento de onda máximo de emissão é 615 nm. Um gráfico de dispersão de duas cores é traçado pelo software de análise de correlação de citometria de fluxo, com IF488 na coordenada horizontal e PI na coordenada vertical. Numa experiência típica, as células vivas não são fluorescentes e o ponto de dispersão está localizado no primeiro quadrante inferior esquerdo. As células em apoptose inicial apresentam uma forte fluorescência verde e a dispersão está no segundo quadrante inferior direito. Células apoptóticas e necróticas em estágio tardio apresentam fluorescência dupla vermelha e verde, com o ponto de dispersão localizado no terceiro quadrante superior direito.

 

2. Detecção por Microscopia de Fluorescência

a) Adicione 5-10 μL de suspensão de células duplamente coradas com Anexina V-IF488 e PI à lâmina.

b) Cubra com uma lamela.

c) Observe com um filtro de duas cores sob um microscópio de fluorescência. A anexina V-IF488 possui um sinal de fluorescência verde e o PI possui um sinal de fluorescência vermelho. (Ao tirar fotos com um microscópio de fluorescência, recomenda-se adicionar uma quantidade apropriada de selante antifluorescência (G1401) para evitar problemas de extinção de fluorescência)

 

 

1. Todo o processo experimental deve ser tratado com o máximo cuidado possível para evitar a fragmentação celular, o que pode afetar os resultados experimentais.

2. A lavagem das células com PBS não pode ser omitida, e o PBS residual também deve ser removido tanto quanto possível.

3. Ao usar tripsina para digerir células, o experimento deve ser realizado com cuidado e o tempo de digestão deve ser controlado para evitar danos artificiais às células. Se o tempo de digestão for muito curto, as células precisam ser batidas vigorosamente para cair, o que pode facilmente causar danos mecânicos à membrana celular; se o tempo de digestão for muito longo, a membrana celular também será facilmente danificada e os resultados serão afetados. Além disso, a tripsina contendo EDTA não pode ser utilizada. O EDTA afetará a ligação da Anexina V ao PS.

4. Se algumas células estiverem flutuando após a estimulação da apoptose, colete o sobrenadante da cultura celular e as células aderentes para corar para obter um resultado mais preciso.

5. Anexina V-IF488 e PI são sensíveis à luz, evite luz durante a operação. O teste deve ser realizado o mais rápido possível após a conclusão da reação.

6. Para sua segurança e saúde, use óculos de segurança, luvas ou roupas de proteção.

 

Somente para uso em pesquisa!

 

 

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