Kit de detecção de proliferação celular Click-iT EdU-488

 

nome do produto	Identificação do produto	modelo
Kit de detecção de proliferação celular Click-iT EdU-488	G1601	100T

 

 

A análise da capacidade de proliferação celular é um método de avaliação comum e importante nas ciências da vida. Pode avaliar a influência de certos genes, medicamentos, etc. nas células cultivadas in vitro, ou analisar a capacidade de crescimento e renovação das células dos tecidos sob diferentes condições ou estimulação. Atualmente, existem muitos métodos para detectar a proliferação celular. A maioria deles usa algumas enzimas metabólicas produzidas pelas células para avaliar indiretamente a atividade de proliferação celular (como o método CCK -8, método MTT, etc.), mas alguns medicamentos ou o estado da própria célula terão um certo impacto sobre os resultados da avaliação. A detecção direta da síntese de DNA em células para determinar a proliferação celular é reconhecida como o método de detecção mais preciso e eficaz. No entanto, tanto o método original de incorporação de nucleósidos radiomarcados como a subsequente melhoria do método BrdU baseado na detecção de anticorpos têm as suas próprias limitações.

EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina, 5-etinil-2'-desoxiuridina) é um análogo da timidina contendo um grupo acetileno, quando injetado em animais ou incubando células cultivadas em vitro, essas pequenas moléculas podem difundir-se rapidamente para vários órgãos e tecidos, infiltrar-se nas células e substituir a timidina (T) no DNA recém-sintetizado durante a proliferação celular. O grupo acetileno na molécula EdU pode reagir com a sonda de composto de azida marcada fluorescentemente iF488 para formar um anel triazol estável sob a catálise de íons de cobre, de modo que o DNA recém-sintetizado possa ser marcado com a sonda fluorescente correspondente. Comparado com o método de incorporação de nucleosídeos radiomarcados, o método de detecção de EdU não possui fatores limitantes, como contaminação radioativa; em comparação com o método de detecção de BrdU, o método de detecção de EdU não requer desnaturação de DNA ou reação antígeno-anticorpo, o que reduz bastante a complexidade do experimento e também torna o experimento mais econômico, mais sensível, mais estável e mais preciso.

Este kit pode ser usado para detectar a proliferação celular em células cultivadas ou tecidos animais. A sonda fluorescente neste kit é de fluorescência verde, o comprimento de onda máximo de excitação é 491 nm e o comprimento de onda máximo de emissão é 516 nm. Depois que as células em proliferação forem marcadas, o núcleo da célula mostrará fluorescência verde brilhante e o núcleo da célula será rotulado em conjunto com o corante nuclear convencional correspondente (este kit fornece corante nuclear de células Hoechst 33342), você pode usar microscópio de fluorescência, microscópio confocal a laser e outros instrumentos para observar diretamente a proliferação celular; você também pode usar citometria de fluxo para detectar a intensidade de fluorescência de células cultivadas in vitro e, em seguida, determinar o ciclo celular com base na intensidade de fluorescência da atividade de replicação do DNA na fase intermediária S.

 

 

O reagente B (corante iF488) deve ser armazenado a -20 graus de distância da luz;

O reagente catalítico EdU (Reagente A) e o tampão de reação podem ser armazenados a 4 graus;

Válido por 12 meses.

 

 

Número do componente	Componente	G1601-100T
G1601-1	Solução de armazenamento EdU (10 mM)	100 μL
G1601-2	Reagente A	120 μL
G1601-3	Reagente B (corante iF488)	50 μL
G1601-4	Reagente C	2 × 100 mg (pó)
G1601-5	tampão de reação	20ml
G1601-6	Solução de coloração Hoechst 33342	30 μL
Manual		1 unidade

Observação: os tempos de reação acima são para o ensaio de placa de 96-poços correspondente.

 

 

1. Meio de cultura celular contendo soro;

2. Solução de permeabilização: 0.2-0,5% Triton X-100 em PBS (recomendamos nosso produto, Cat.#:G1204);

3. Solução fixadora: paraformaldeído a 4% em PBS, pH 7,4 (recomende nosso produto, Cat.#:G1101);

4. Buffer PBS (recomende nosso produto, Cat.#:G4202);

5. Água ultrapura;

6. Reagentes relacionados à modelagem animal e ao seccionamento de tecidos (ensaio de proliferação de células de tecido animal).

 

 

1. Pré-tratamento de células cultivadas in vitro:

1.1. Plante as células uniformemente na placa de cultura celular a uma certa densidade (a densidade de plantio é determinada por fatores como tamanho da célula, velocidade de crescimento, etc.). Depois que as células aderirem à parede ou retornarem ao estado normal, realize a estimulação medicamentosa correspondente e outros tratamentos. (Para células em suspensão, siga o método de operação normal das células em suspensão. Todo o experimento precisa adicionar centrifugação e outras etapas).

1.2. O aditivo catalítico (Reagente C) foi centrifugado em baixa velocidade, 100 mg foram retirados e dissolvidos pela adição de 1 mL de água ultrapura e dispensados ​​e armazenados a -20 grau, o pó restante foi mantido como reserva.

 

2. Rotulagem, fixação e permeabilização de EdU celular in vitro:

2.1. Prepare a solução de trabalho de incubação 2×EdU: adicione 2 μL de solução de armazenamento EdU (10 mM) a cada 1 mL de meio de cultura celular completo, que é 20 μM de solução de trabalho de incubação 2×EdU, e coloque-a na incubadora para pré-aquecer (o recomendado A concentração de trabalho da EdU é de 10 μM para experimentos preliminares);

2.2. No modo de meia mudança, aspire metade do meio de cultura celular original na placa de cultura e adicione um volume igual de solução de trabalho de incubação 2×EdU pré-aquecida e incube por um determinado período de tempo (a duração da incubação geralmente depende no ciclo de crescimento das células correspondentes, que geralmente representa cerca de 10% do ciclo celular. Para células principalmente aderentes e de crescimento rápido, recomenda-se a incubação por cerca de 2 h. as características da célula, a situação real após o tratamento, etc. Se for necessário um tempo de incubação mais longo, a concentração de trabalho de EdU pode ser reduzida adequadamente por um período de tempo mais curto, a concentração de EdU pode ser aumentada adequadamente);

2.3. Após a incubação da EdU, lave com tampão PBS por 1-2 vezes, adicione fluido de fixação para cobrir as células e fixe à temperatura ambiente por 15 minutos (se for necessária citometria de fluxo, as células aderentes devem ser digeridas e ressuspensas antes desta etapa corrigir, siga o método de processamento de células em suspensão); Lave 2-3 vezes com buffer PBS, 3-5 min de cada vez;

2.4. Remover o tampão PBS, adicionar solução de permeabilização para cobrir as células e incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos;

2.5. Remova a solução de permeabilização, lave 1-2 vezes com tampão PBS, 3-5 min de cada vez. Em seguida, vá para a etapa 4.

 

3. Modelagem de injeção de animais EdU, bem como processamento de seções de tecido:

3.1. De acordo com os requisitos experimentais, uma ou mais injeções de EdU são usadas para modelar animais por injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção subcutânea, injeção na veia da cauda, ​​etc. Geralmente, a proporção entre a dosagem de EdU e o peso corporal do animal é de 5 mg/kg, o real a dose de injeção depende do conteúdo da pesquisa e das condições do animal. A solução de armazenamento de EdU fornecida neste kit é usada principalmente para rotulagem de EdU de células in vitro. Se precisar modelar um animal com EdU, você pode solicitar o reagente EdU separadamente (Cat. No.: G5059);

3.2. As células epiteliais, como as do intestino delgado, proliferam rapidamente, enquanto as células cerebrais proliferam lentamente. Os tecidos de crescimento mais rápido geralmente levam menos de 12 horas para serem rotulados, enquanto os tecidos de crescimento mais lento podem levar vários dias para serem rotulados. O tempo ideal de rotulagem foi determinado de acordo com o experimento específico. Devido à rápida proliferação do tecido epitelial intestinal, tal tecido foi recomendado como referência para rotulagem.

3.3. Depois que o animal é morto de acordo com os padrões especificados, os tecidos necessários são retirados e cortes congelados ou parafina são feitos de acordo com os procedimentos convencionais:

um. Para cortes congelados: retorne os cortes à temperatura ambiente, adicione uma quantidade apropriada de Fluido Fixador e fixe em temperatura ambiente por 15 minutos. Remova o fluido de fixação e lave 3 vezes com tampão PBS por 3-5 min cada; remover o tampão PBS e cobrir o tecido com uma quantidade adequada de solução de permeabilização e incubar à temperatura ambiente durante 10-15 min; remova a solução de permeabilização e lave com tampão PBS 1- 2 vezes, 3-5 min de cada vez. Em seguida, vá para a etapa 4.

b. Para seções de parafina: Desparafinize e reidrate as seções e lave com PBS por 5 min. Remover o tampão PBS, adicionar solução de permeabilização para cobrir as células ou tecidos e incubar à temperatura ambiente durante 15 min; Em seguida, lave com tampão PBS por 1-2 vezes, cada vez por 3-5 min. Em seguida, vá para a etapa 4.

 

4. Reação de clique do EdU:

4.1. Durante a fixação e perfuração de células ou tecidos, preparação da solução de reação: misturar os reagentes de acordo com a seguinte proporção, o volume de preparação pode ser aumentado ou diminuído em proporção ao número de amostras.

 

Componente	Volume (para célula)	Volume (para corte histológico)
tampão de reação	935 μL	928 μL
Reagente A	10 μL	10 μL
Reagente B (corante iF488)	5 μL	12 μL
Reagente C	50 μL	50 μL
capacidade total	1000 μL	1000 μL

 

4.2. Remova o tampão PBS das células ou seções, adicione a solução de reação, agite suavemente para garantir que a solução de reação cubra todas as células ou tecidos e incube por 30 min à temperatura ambiente no escuro;

4.3. Remova a solução de reação, lave 2-3 vezes com tampão PBS, 3-5 min de cada vez (se não houver outro requisito especial, a intensidade de fluorescência pode ser detectada por citometria de fluxo ou o efeito de fluorescência pode ser detectado por outros instrumentos).

 

5. Mancha nuclear (opcional):

5.1. Diluir a solução de coloração Hoechst 33342 com tampão PBS na proporção de 1:500-1000, adicionar à amostra para cobrir as células e incubar por 5 min;

5.2. Remova a solução de coloração Hoechst 33342, lave 2-3 vezes com tampão PBS, 3-5 min de cada vez.

6. Análise de imagem e detecção:

Use microscópio de fluorescência ou microscópio confocal para detectar células processadas ou amostras de seções de tecido e analisar a proporção de células em proliferação. Alternativamente, as células cultivadas in vitro podem ser coletadas e a intensidade de fluorescência pode ser medida por citometria de fluxo (recomenda-se usar amostras de células não marcadas com EdU como controle negativo para o ensaio de citometria de fluxo e escolher a voltagem apropriada), e com base na intensidade de fluorescência, a atividade de replicação do DNA da fase S no ciclo celular pode ser determinada. O corante fluorescente iF488 (Reagente B) deste kit corresponde à caracterização espectral de Ex/Em: 491 nm/516 nm (verde); A solução de coloração Hoechst 33342 corresponde à caracterização espectral de Ex/Em: 346 nm/460 nm (azul).

 

 

1. Para células cultivadas, a concentração específica de EdU e o tempo de incubação podem ser ajustados adequadamente dependendo da amostra e do objetivo da pesquisa.

2. Algumas células do tecido proliferam lentamente. Para evitar um efeito de modelagem deficiente, recomenda-se selecionar amostras de tecido com proliferação rápida como amostras de referência (como tecido intestinal).

3. Se a cor de fundo estiver muito escura, isso pode ser causado por lavagem insuficiente, fixação prolongada e fixador residual, etc.

4. O reagente C (reagente de adição catalítica EdU) é fácil de oxidar. Tente evitar a exposição prolongada ao ar. Depois de preparado em solução aquosa, recomenda-se armazenar em alíquota; Testado, como a cor do reagente aditivo catalítico EdU muda ligeiramente, o sistema catalítico de reação de clique ainda é capaz de prosseguir normalmente. se o reagente C aparecer marrom, indica que o componente expirou, portanto descarte-o.

5. Para sua saúde e segurança, use jalecos e luvas durante a operação.

 

Somente para uso em pesquisa!

 

 

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