Kit de extração de RNA FFPE

 

Nome do produto	Gato.Não.	Especificações.
Kit de extração de RNA FFPE	G3642-50T	50 T

 

 

O kit é adequado para extração de RNA de tecido fixado em formalina e embebido em parafina (FFPE), usando reagente de desparafinação especial, sem xileno e outros solventes orgânicos, seguro e não tóxico, pode remover efetivamente a parafina e liberar amostras de tecido. O kit pode lisar tecido com eficiência usando tampão de lise especial, e o RNA do tecido embebido em parafina pode ser extraído de forma rápida e eficaz pelo método de coluna centrífuga. O processo de extração pode ser concluído em 1 hora e o RNA tem alto rendimento, alta pureza e integridade, por isso é adequado para experimentos de biologia molecular downstream, como RT-PCR e PCR em tempo real.

 

 

DNase e Proteinase K são enviadas com gelo úmido e armazenadas a -20 grau. Outros reagentes foram enviados e armazenados em temperatura ambiente; válido por 12 meses.

 

 

Número do componente	Componente	G3642-50T
G3642-1	DP de buffer	30ml
G3642-2	CRL do buffer	10ml
G3642-3	Proteinase K	1ml
G3642-4	Tampão FRB	10ml
G3642-5	DNase	500 μL
G3642-6	Tampão de reação 10×DNase	500 μL
G3642-7	Tampão RW1	30ml
G3642-8	Tampão RW2	16 mL (64 mL de etanol anidro adicionado antes do uso)
G3642-9	Água sem nuclease	10ml
G3642-10	Colunas de rotação de RNA	50 conjuntos
Manual		Uma cópia

 

 

1. Prepare blocos de aquecimento a 80 graus e 55 graus com antecedência.

2. Se o tampão CRL e o tampão FRB precipitarem, aqueça a 65 graus para dissolver e use-o após retornar à temperatura ambiente.

3. Prepare apenas parte da solução de trabalho de DNase necessária para a experiência.

4. Adicione 64 mL de etanol anidro ao Tampão RW2 antes do primeiro uso, misture bem e depois use.

 

 

1. Preparação de amostras:

um. Seções de parafina: raspar 5~8 seções de parafina (5~10 μm de espessura, tamanho 1×1 cm2). Se a amostra for exposta ao ar, as 2 a 3 peças na superfície serão descartadas.

b. Blocos de parafina: raspar a amostra de tecido de cerca de 30 mg com um bisturi esterilizado, retirar o máximo possível o excesso de parafina e cortar a amostra.

c. Amostra de tecido embebido em formalina: seque o líquido na superfície da amostra com papel de filtro, pegue cerca de 30 mg de amostra, corte-a e coloque-a em tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicione 500 μL de tampão 1×PBS (pH 7,4), oscilação de vórtice para 10 s, depois centrifugar a 12,{9}} rpm por 1 min em temperatura ambiente, descartar o sobrenadante, repetir 3 vezes.

2. Transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicione 500 μL de Tampão DP, incube a 80 graus por 3 min e oscile no vórtice por 10 s enquanto a amostra está quente.

3. Adicione 200 μL de tampão CRL ao tubo de centrífuga, misture bem com vórtice, centrifugue a 12,{3}} rpm por 1 min em temperatura ambiente e forme duas camadas de solução (a camada superior é a fase oleosa, a camada inferior é fase aquosa).

4. Adicione 20 μL de Proteinase K à fase aquosa inferior, misture suavemente com uma pipeta (tente não destruir a estratificação), incube a 55 graus por 15 min.

5. Em seguida, transfira o tubo de centrífuga para um bloco de aquecimento de 80 graus, incube por 15 minutos (se houver apenas um bloco de aquecimento, coloque primeiro o tubo de centrífuga contendo a amostra em temperatura ambiente e, em seguida, coloque o tubo de centrífuga no bloco de aquecimento quando a temperatura atinge 80 graus), misture de cabeça para baixo.

6. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min à temperatura ambiente e formar duas camadas de solução (a camada superior é a fase oleosa, a camada inferior é a fase aquosa).

7. Remova a solução aquosa da camada inferior para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL sem Nuclease (não obtenha a solução da fase oleosa superior e outras impurezas). Adicionar Tampão FRB com igual volume de fase aquosa e etanol anidro com 3 vezes o volume de fase aquosa (pode haver precipitação), e usar pipeta de líquido para soprar e misturar bem.

8. Transfira toda a mistura para RNA Spin Column, centrifugue a 12,000 rpm por 2 min em temperatura ambiente e descarte o filtrado.

9. Prepare a solução de trabalho DNase: coloque 35 μL de água livre de nuclease, 5 μL de tampão de reação 10×DNase e 10 μL de DNase em um novo tubo de centrífuga sem nuclease, misture suavemente com uma pipeta.

10. Adicione a gota da solução de trabalho DNase ao centro da membrana da RNA Spin Column e deixe em temperatura ambiente por 15 minutos.

11. Adicione 500 μL de tampão RW1 à coluna de rotação de RNA, centrifugue a 12000 rpm por 1 min em temperatura ambiente e descarte o filtrado.

12. Adicione 600 μL de tampão RW2 à coluna de rotação de RNA (adicione o tampão RW2 ao longo da parede do tubo para ajudar a liberar o sal residual na parede do tubo), centrifugue a 12,000 rpm por 1 min em temperatura ambiente e descarte o filtrado.

13. Repita a etapa 12.

14. Coloque a RNA Spin Column no tubo de coleta e centrifugue a 12000 rpm por 2 min em temperatura ambiente. Retire a coluna de rotação de RNA e coloque-a em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL sem nuclease.

15. Abra a tampa da RNA Spin Column, deixe-a em temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para fazer o etanol evaporar completamente.

16. Adicione 50 ~ 100 μL de água livre de nuclease ao centro da membrana da coluna giratória de RNA, deixe em temperatura ambiente por 5 minutos, centrifugue a 12,000 rpm por 2 min para coletar a solução de RNA. Para obter uma concentração mais elevada de RNA, você também pode adicionar o primeiro eluente de volta à coluna Spin Spin, depois ficar à temperatura ambiente por 5 min e centrifugar por 2 min para eluir o RNA novamente.

 

 

1. Leia atentamente o manual do produto antes de usar.

2. O rendimento e a integridade do RNA extraído por este kit dependem do tipo de amostra, do tempo fixo, da condição fixa e do tempo de armazenamento da amostra. O tempo fixo é preferencialmente de 8 a 24 horas. Se o tempo fixo da amostra for superior a 24 horas ou o tempo de armazenamento for superior a 1 ano, pode levar a um grande número de degradação do RNA.

3. As amostras devem ser completamente desidratadas antes da incorporação para evitar que a formalina residual afete os experimentos de acompanhamento.

4. Ao coletar amostras de tecido incorporado, devemos remover o excesso de parafina e cortar a amostra o máximo possível, e a quantidade de amostragem não deve exceder 30 mg, caso contrário, é fácil causar lise insuficiente e afetar o rendimento de ácido nucleico.

5. Os ácidos nucleicos purificados a partir de amostras FFPE não são recomendados para aplicações a jusante que requerem RNA completo.

6. Use roupas de laboratório, luvas descartáveis ​​e máscaras durante o experimento, evite falar e use pontas de pipetas e tubos de centrífuga sem Nuclease para evitar contaminação cruzada.

7. Bancada de teste de operação especial de extração de RNA e equipamento de eletroforese devem ser usados.

 

Somente para uso em pesquisa!

 

 

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