2×In-Fusion Cloning Mix Plus

 

Nome do produto	Gato. Não.	Especificações.
2% c3% 97Em fusão clonagem mistura mais	G3351-20T	20 T
	G3351-100T	100 T

 

O 2×In-Fusion Cloning Mix Plus oferece maior eficiência de clonagem em relação às gerações anteriores de kits In-Fusion (G3350,2×In-Fusion Cloning Mix), especialmente para fragmentos múltiplos. Ele foi projetado para clonagem rápida e direcional de um ou 2 a 5 fragmentos múltiplos de DNA em qualquer vetor. Ele funde fragmentos de DNA (por exemplo, inserções geradas por PCR e vetores linearizados) de forma eficiente e precisa, reconhecendo sobreposições de 15-25 pb em suas extremidades. Essas sobreposições de 15-25 pb podem ser projetadas projetando primers para amplificação das sequências desejadas. A inserção simultânea de vários fragmentos simplifica muito as etapas experimentais, melhora a eficiência da clonagem e economiza seu tempo.

 

1. Projeto de iniciador de fragmento único: sequências de 15-25 pb consistentes com ambas as extremidades do vetor linearizado foram introduzidas na extremidade 5' do iniciador de amplificação da inserção. Projete o diagrama abaixo:

2. Projeto de primer multifragmento: Os princípios do projeto de primer em ambas as extremidades do vetor são os mesmos dos primers de fragmento único. O princípio de design da zona de reinicialização entre o primer de fragmento é o seguinte: Há uma sobreposição de 15-25 pb entre o primer reverso do Fragmento 1 e o primer direto do Fragmento 2. O primer reverso para o Fragmento 1 inclui a região de sobreposição e o específico reverso região de iniciador, o iniciador directo para o Fragmento 2 inclui a região de sobreposição e a região de iniciador específico directo, e assim por diante (regiões sobrepostas são mostradas em vermelho). Para melhorar a eficiência, as regiões sobrepostas entre os fragmentos podem ser aumentadas e os seus valores de Tm são garantidos como consistentes. O projeto é o seguinte:

 

 

Navio com gelo molhado; armazenado em -20 grau, válido por 12 meses.

 

 

Componente	G3351-20T	G3351-100T
2% c3% 97Em fusão clonagem mistura mais	100 μL	5 x 100 μL
pUC19 (linearizado, vetor de controle, 5 ng/μL)	10 μL	10 μL
Inserção de controle (10 ng/μL)	10 μL	10 μL
Manual	Uma cópia

 

 

Realizar reação de ligadura

1. Em um tubo de microcentrífuga autoclavado de 1,5-ml, adicione o seguinte (recomendado sistema de reação 10-uL):

Componente	Volume
2% c3% 97Em fusão clonagem mistura mais	5 μL
DNA vetorial	X μL
Inserir DNA	Y μL
Água Livre de Nuclease	Adicione a 10 μL

 

2. Misture delicadamente e centrifugue brevemente para levar o conteúdo ao fundo do tubo.

3. Para reações de recombinação de fragmento único, incubar a 50 graus por 15 minutos; Para a recombinação multifragmento, incubar a 50 graus por 30 minutos.

 

OBSERVAÇÃO:Para 3-5 recombinação multifragmento, aumentar o tempo de reação produzirá mais colônias, mas não deve exceder 1 h).

4. Coloque o tubo no gelo e prossiga imediatamente para “Executar reação de transformação”.

 

 

5. Adicione a reação de ligação apropriada em E. coli Quimicamente Competente (como DH5, Top10, etc.) e misture suavemente. Não misture pipetando para cima e para baixo.

6. Incubar durante 30 minutos em gelo.

7. Aplicar choque térmico nas células durante 30 segundos num banho-maria a 42 graus.

8. Coloque imediatamente os tubos em gelo e incube durante 2 minutos.

9. Adicione 900 µL de meio SOC ou LB à temperatura ambiente. Tampe bem o tubo e agite-o horizontalmente a 225 rpm por 1 hora a 37 graus.

10. Espalhe o volume necessário da reação de transformação em uma placa LB pré-aquecida contendo os antibióticos correspondentes.

11. Incubar as placas durante a noite a 37 graus.

 

 

Escolha uma colônia individual da placa de transformação, analise os transformantes por PCR de colônia ou digestão com enzimas de restrição.

 

 

1. O DNA do vetor e o DNA inserido devem ser purificados em gel e sua qualidade e concentração analisadas por eletroforese. A água pode ser omitida na reação de ligação se a concentração for baixa.

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 graus.

3. Recomenda-se que a proporção molar do vetor e da inserção seja de 1:1 ~ 1:3; quando 2-3 fragmentos são conectados, a razão molar entre cada fragmento é 1:1, e o sistema de reação de ligação pode ser aumentado em proporções iguais.

4. Se o volume total do vetor e da inserção for superior a 5 μL, você poderá dimensionar o sistema de ligação para 20 μL.

5. O volume do produto de ligação não deve exceder 1/10 do volume das células competentes, caso contrário a eficiência da transformação será significativamente reduzida. O volume do produto de ligação e das células competentes pode ser aumentado em proporções iguais (por exemplo, 20 μL de sistema de ligação transforma 200 μL de células competentes).

6. O 2×Universal Ligation Mix deve ser mantido a -20 grau até 5-10 minutos de uso e retornado imediatamente a -20 grau após o uso. Recomenda-se congelar em alíquotas para reduzir os ciclos de congelamento e descongelamento.

7. Se for utilizada electroporação para transformação, o ADN do vector e o ADN inserido devem ser purificados pelo método de coluna ou pelo método de precipitação com etanol.

 

 

1. Diagrama do processo experimental de construção de plasmídeo recombinante

 

A. Os fragmentos de DNA inseridos foram obtidos por amplificação por PCR: A sequência homóloga de 15-25 pb (verde e azul claro) da extremidade do vetor linearizado foi introduzida na extremidade 'dos ​​primers direto/reverso do fragmento alvo, e o As sequências terminais 5' e 3' do produto amplificado eram completamente consistentes com as duas sequências terminais do vector linearizado, respectivamente.

B. Linearização do vetor plasmídico: Endonuclease de restrição ou PCR reversa foram utilizadas para obter vetores linearizados.

C. In-Fusion Cloning Plus: O transportador linearizado e o fragmento de inserção purificado e recuperado foram misturados proporcionalmente e a reação foi completada a 50 graus durante 15 min.

D. Células transformadas: Produtos de reação diretamente em células competentes de escherichia coli, crescimento de colônias monoclonais, retirado do comprimido para PCR, digestão enzimática e sequenciamento experimental de triagem de clones positivos.

 

2. Diagrama de processo experimental de construção de plasmídeo recombinante de mutações de ponto único

A. PCR de dois fragmentos (PCR amplifica fragmentos de DNA em ambas as extremidades do local de mutação): Iniciadores complementares foram projetados no local de mutação (laranja), e iniciadores foram projetados em ambas as extremidades do gene mutante para introduzir sequências homólogas no final do vetor linearizado 15-25 bp (verde e azul claro). Utilizando diferentes iniciadores para a amplificação por PCR, respectivamente, mutações em duas peças com as sequências homólogas de duas mutações genéticas de fragmentos de inserção (incluem), respectivamente.

B. Linearização do vetor plasmídico: Endonuclease de restrição ou PCR reversa foram utilizadas para obter vetores linearizados.

C. In-Fusion Cloning Plus: O transportador linearizado e o fragmento de inserção purificado e recuperado foram misturados proporcionalmente e a reação foi completada a 50 graus durante 15 min.

D. Células transformadas: Produtos de reação diretamente em células competentes de escherichia coli, crescimento de colônias monoclonais, retirado do comprimido para PCR, digestão enzimática e sequenciamento experimental de triagem de clones positivos.

 

3. Diagrama esquemático do processo experimental de construção de plasmídeo recombinante de inserção multifragmento

A. Amplificação por PCR de fragmentos adicionais: As sequências homólogas (marcadas em verde, azul escuro, amarelo e azul claro) foram adicionadas à extremidade 5' dos primers de amplificação, de modo que houvesse uma sequência homóloga de 15-25 pb entre os produtos de amplificação e entre os produtos de amplificação e o vetor linearizado. Diferentes pares de primers foram utilizados para amplificar os fragmentos de DNA (marcados em laranja, vermelho e roxo).

B. Linearização do vetor plasmídico: Endonuclease de restrição ou PCR reversa foram utilizadas para obter vetores linearizados.

C. In-Fusion Cloning Plus: O transportador linearizado e o fragmento de inserção purificado e recuperado foram misturados proporcionalmente e a reação foi completada a 50 graus durante 15 min.

D. Células transformadas: Produtos de reação diretamente em células competentes de escherichia coli, crescimento de colônias monoclonais, retirado do comprimido para PCR, digestão enzimática e sequenciamento experimental de triagem de clones positivos.

 

Somente para uso em pesquisa!

 

 

Tag: 2 × mistura de clonagem em fusão plus, China 2 × mistura de clonagem em fusão mais fabricantes, fornecedores, fábrica